Revista de Métodos de Diagnóstico Médico
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Abstrato

Ensaios de exclusão de corantes em duas etapas específicos para espermatozoides para avaliar a integridade das membranas de plasma e organelas - Nova abordagem para garantia de qualidade do esperma para injeção intracitoplasmática de espermatozoides

Satoru Kaneko, Yuki Okada, Kiyoshi Takamatsu

Objetivo: As avaliações abrangentes das membranas plasmáticas e organelas são uma nova abordagem para entender a fertilidade do esperma humano. O presente estudo desenvolveu 2 tipos de ensaios de exclusão de corante de 2 etapas específicos para esperma para avaliar as membranas plasmáticas e organelas no esperma humano.

Métodos: Ensaio de exclusão de corante específico de espermatozoides em 2 etapas: O espermatozoide foi incubado com vermelho reativo 195 (RR195) ou concanavalina A conjugada com Cy3 (Cy3-con A) em meio de cultura isotônico, eles foram contracorados com azul reativo 222 ou concanavalina A conjugada com Alexa 488 após exclusão da membrana plasmática com metanol, respectivamente. A integridade da membrana da organela na mitocôndria foi observada pela retenção do Mito Tracker FM. O cellROX Orange produziu fluorescência laranja após oxidação por espécies reativas de oxigênio reagidas.

Resultados: O ensaio de exclusão de corante específico de espermatozoides em 2 etapas é composto de permeação e ligação do primeiro corante aos núcleos através de membranas de plasma e organelas danificadas, após a exclusão da membrana, núcleos recém-expostos ou a membrana acrossômica interna foram contracorados com o segundo corante. O intacto nas membranas plasmáticas e acrossômicas em espermatozoides móveis humanos (espermatozoides vivos; LS) excluíram RR195 e Cy3-con A, mas aqueles desnaturados permitiram permeações. LS coloriu o bulbo ou produziu fluorescência verde, por um lado, aqueles desnaturados fizeram fluorescência vermelha ou vermelha, respectivamente. A fluorescência do Mito Tracker FM e do cellROX Orange nas mitocôndrias certificou a normalidade da fosforilação oxidativa nas mitocôndrias com membrana de organela intacta. O ensaio de exclusão derivado de RR195 em uma única etapa é um candidato viável para avaliação intraoperatória não destrutiva do espermatozoide móvel em ICSI clínica.

Conclusão: Os ensaios de exclusão e retenção de corante contribuem como avaliações pré-operatórias das qualidades do esperma e o ensaio de exclusão de corante modificado em uma única etapa pode ser útil para a seleção intraoperatória de esperma na injeção intracitoplasmática clínica de esperma, respectivamente.