Avanços em Engenharia Genética
Acesso livre
ISSN: 2169-0111
ISSN: 2169-0111
Cédric Happi Mbakam
Mutações no gene da distrofina levam a distúrbios neuromusculares, como a Distrofia Muscular de Duchenne, que é uma doença hereditária letal ligada ao X com uma prevalência de 19,8 por 100.000 nascimentos do sexo masculino. As terapêuticas clínicas atualmente disponíveis com corticosteroides ou com injeções de oligómeros anti-sentido de morfolino proporcionam uma melhoria fenotípica limitada. O nosso estudo teve como objetivo medir a eficiência da tecnologia PRIMEediting. Esta tecnologia utiliza um plasmídeo editor PRIME (PE2 ou PE3) que codifica uma transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney fundida com a nickase Cas9 H840A e um plasmídeo que codifica um pegRNA contendo locais de ligação de primer (PBS) e um modelo de transcriptase inversa (RTT). Permite substituições, deleções ou inserções específicas de nucleótidos no genoma. Desenhámos diferentes pegRNAs direcionados para vários hDMDexons (9, 20, 35,43, 51, 55 e 61) para introduzir um códon STOP modificando um único nucleótido. As células HEK293T foram colhidas de meio de cultura DMEM três dias após terem sido transfectadas simultaneamente com PE2 e pegRNA. Os exons foram amplificados por PCR e sequenciados pelo método Sanger. Os resultados foram analisados utilizando o programa EditR para estimar a percentagem de edição. Confirmámos que a edição PRIME permite as substituições específicas de C para T e G para T no gene DMD com uma eficiência de edição entre 6 a 11% (PE2) e 21% (PE3). As transfecções repetidas 6 dias após a primeira mostraram uma edição até 15% (PE2) nos exons 9 e 35. Uma mutação adicional na sequência PAM (exon 35) melhorou o resultado do PE2 para 38% para uma única transfecção. Assim, a edição PRIME permite substituições específicas no gene DMD e pode ser utilizada para corrigir mutações pontuais no gene DMD para levar à expressão da distrofina.