Jornal de Oftalmologia Clínica e Experimental
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Abstrato

Sinal cromatográfico amplificado e espectroscopia de absorvância UV para avaliar a lisozima após desnaturação térmica e em extratos de lentes de contacto

Claude J Giasson, Danielle Béland e Langis Michaud

Objectivo: Amplificar o sinal de absorbância relacionado com a lisozima extraída de lentes de contacto medida por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC); examinar a pureza da lisozima e quanto a desnaturação térmica afeta o seu perfil de eluição.
Métodos: Nos ensaios cromatográficos durante os quais foram injetados extratos de lentes de contacto no sistema, as frações recolhidas entre os 4 e os 5,5 minutos apontaram a lisozima como a proteína eluente, como indicado por um Western blot. As proteínas foram extraídas de lentes de contacto numa solução 50:50 de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,2%: acetonitrila (ACN). Cada extrato de lentes de contacto foi separado em 2 alíquotas. Após evaporação a vácuo, as alíquotas nº 1 foram dissolvidas na fase móvel inicial para produzir um factor de enriquecimento de 8. As alíquotas nº 2 foram deixadas sem tratamento na solução de extracção regular. A calibração do sinal de absorvância a 220 nm permitiu medir os níveis de lisozima em cromatogramas. Injecções paralelas de ambas as alíquotas no HPLC permitiram comparar o seu conteúdo em lisozima. A pureza da lisozima extraída foi avaliada observando o seu espectro de absorção através dos picos. As soluções de lisozima, previamente aquecidas a 80 e 100°C, foram injetadas e comparadas com as soluções controlo. As diferenças no teor médio de lisozima entre as alíquotas nº 1 e 2 e na área do pico da lisozima aquecida em comparação com o controlo foram testadas com métodos não paramétricos.
Resultados: O nível médio de lisozima medido nos extratos enriquecidos e regulares diferiu significativamente (39,8 e 21,5 μg, respetivamente). No entanto, uma vez corrigido para diferentes volumes de injeção e fator de concentração, o nível médio de lisozima enriquecida (21,4 μg) foi próximo do encontrado no extrato regular. A observação da absorvância espectral sugere que a eluição da lisozima está isenta de contaminantes. As razões medianas das áreas dos picos da lisozima aquecida sobre a área dos picos da lisozima de controlo diferiram significativamente de 1 à temperatura de 100°C (0,91), mas não à de 80°C (0,95) com o teste de classificação sinalizada. Mesmo quando aquecido a 80°C, o perfil de eluição da lisozima pareceu menos simétrico em comparação com o controlo e apresentou um ponto de inflexão adicional. Estas mudanças subtis aumentaram a 100°C.
Conclusão: O enriquecimento da lisozima extraída das lentes de contacto e solubilizada na fase móvel inicial melhora a sensibilidade deste procedimento cromatográfico. Este protocolo cromatográfico acoplado à espectroscopia de absorbância UV pode detetar a desnaturação térmica a 80 e 100°C.