Wilson Lewis Mandala1
Respostas mediadas por células a estímulos imunológicos são frequentemente localizadas em locais inflamatórios e envolvem vários tipos de células. Essas respostas podem ser caracterizadas funcionalmente no nível de célula única com base nos tipos de citocinas expressas. A capacidade de medir respostas celulares específicas de antígeno no nível de célula única é uma ferramenta importante com uma ampla gama de aplicações potenciais que vão desde estudos de patogênese de doenças até a avaliação de vacinas. Vários experimentos foram realizados neste estudo para estabelecer as condições ideais para estimular a produção de citocinas in vitro por linfócitos e monócitos em amostras de sangue coletadas de participantes adultos saudáveis do Malawi e as condições ideais de coloração para várias citocinas e tipos de células. Diferentes métodos e condições de estimulação, diferentes tubos de cultura e incubadoras e diferentes condições de marcação de anticorpos foram avaliados para estabelecer condições ideais.
O uso de PMA mais Ionomicina produziu as células T mais produtoras de citocinas, enquanto o LPS foi um estimulante melhor para monócitos produtores de citocinas. A estimulação do sangue total por cinco horas foi ótima para a detecção de citocinas em células T, enquanto quatro horas foram ótimas para monócitos. O BFA foi considerado um melhor bloqueador de Golgi do que a Monensina e o uso de tubos de polipropileno tipo Falcon de 15 ml enquanto estacionários resultou na detecção da maior proporção de células produtoras de citocinas. As células T foram consideradas produtoras principalmente de TNF-α, IFN- e IL-2, enquanto os monócitos produziam principalmente TNF-α e IL-6. 2 µl de anti-CD3-PerCP, 2 µl de anti-CD14-APC e 4 µl de anti-citocina-PE resultaram nos melhores resultados. Os monócitos com maior produção de citocinas foram detectados quando 2 ml de solução de lise FACS foram usados em comparação com os outros volumes. Essas condições ótimas são essenciais na determinação da proporção de células produtoras de citocinas usando ICS.