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Abstrato

A seleção da puromicina confunde os perfis de RNA-Seq dos eritroblastos humanos primários

Guo RL, Lee YT, Byrnes C e Miller JL*

A transdução lentiviral seguida de seleção de puromicina é um procedimento bem reconhecido para a transferência de genes e experiências de expressão utilizando uma variedade de tipos de células, incluindo células estaminais hematopoiéticas humanas e células progenitoras. Apesar da sua vasta aplicação, a investigação sobre os potenciais efeitos da expressão do gene bacteriano da puromicina N-acetiltransferase (pac) em culturas de células de mamíferos está incompleta. Aqui, o potencial de seleção da puromicina para afetar os perfis do transcriptoma foi examinado utilizando um modelo bem estudado para a eritopoiese humana. As experiências foram realizadas utilizando células CD34 (+) primárias de seis dadores humanos adultos saudáveis, transduzidas com dois vectores lentivirais codificadores de pac comercialmente disponíveis e comparadas com células de controlo não transduzidas. Os perfis de expressão genética de RNA-Seq foram gerados na fase de diferenciação de proeritroblastos e, em seguida, a expressão diferencial de genes foi analisada com o DEseq2 no software R-Studio. A variação entre dadores nos perfis de expressão genética e as variações entre populações selecionadas de puromicina após a transdução dos vetores lentivirais separados foram manifestadas por diferenças significativas nos níveis de deteção de RNA inferiores a 0,1%. No entanto, a selecção da puromicina após a transdução do gene pac provocou alterações significativas em mais de 5% do ARNm quando comparado com os controlos não transduzidos. Os resultados sugerem que deve ser considerado o potencial da seleção da puromicina para confundir a interpretação dos perfis do transcriptoma RNA-Seq.