Jornal de termodinâmica e catálise
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Abstrato

A hidrofobicidade reduzida do loop de intercalação do sulco menor é crítica para a catálise eficiente pela N-glicosilase de uracila-DNA adaptada ao frio do bacalhau do Atlântico

Elin Moe, Netsanet Gizaw Assefa, Ingar Leiros, Kathrin Torseth, Arne O Smalås e Nils Peder Willassen

O loop de intercalação do sulco menor (loop de leucina) em Uracil-DNA N-glicosilases (UNGs) sofre mudanças conformacionais significativas após a interação do substrato. Estudos anteriores mostraram que o UNG de bacalhau do Atlântico adaptado ao frio (cUNG) possui uma eficiência catalítica dez vezes maior do que o UNG humano (hUNG). Um alinhamento de sequência das duas enzimas revelou substituições de aminoácidos dentro e perto do loop de leucina de cUNG, o que pode aumentar a elasticidade do loop e, assim, explicar a maior eficiência catalítica observada de cUNG em comparação com hUNG. Para investigar essa hipótese, construímos cinco mutantes simples e quatro múltiplos de cUNG com substituições de bacalhau para UNG humano e os caracterizamos por experimentos cinéticos em três temperaturas diferentes (15, 22 e 37 °C) e Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). Os resultados mostraram que as mutações afetaram o kcat mais do que o KM, e mutantes com propriedades hidrofóbicas aparentemente reduzidas (A266T, V267A, A266T/V267A e A266T/V267A/A274V) mostraram kcat aumentado ou equivalente ao cUNG, enquanto mutantes com hidrofobicidade aumentada prevista (A274V, H275Y, L279F, A266T/V267A/A274V/H275Y e A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q) mostraram kcat reduzido em comparação ao cUNG. Assim, imitar a composição de aminoácidos do loop de leucina em hUNG reduz a atividade do cUNG. Os experimentos de DSC foram realizados para identificar um aumento potencial na estabilidade geral dos mutantes como resultado da hidrofobicidade alterada do loop de leucina. No entanto, os resultados mostraram uma ligeira redução na estabilidade geral para mutantes com kcat aumentado e estabilidade aumentada para mutantes com kcat reduzido. Sugerimos que esses resultados surgem de uma necessidade de compensar uma elasticidade potencial aumentada/reduzida do loop de leucina que é introduzida pelas substituições de aminoácidos. Este estudo confirma a importância sugerida do loop de leucina para catálise eficiente de UNG e mostra que é possível alterar a capacidade catalítica desta enzima manipulando a composição de aminoácidos deste loop.