Jornal de Oftalmologia Clínica e Experimental
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Abstrato

Procurando variantes de splicing alternativo do domínio fosfolipase contendo 2 (Pnpla2), um novo gene na retina

Jacqueline Talea DesJardin, S Patricia Becerra e Preeti Subramanian

Objectivo: O Ensembl e outras bases de dados de sequências expressas (EST) revelam possíveis variantes de splicing alternativas em ratinhos e ratos para o Pnpla2 , o gene que codifica o receptor do factor derivado do epitélio pigmentar (PEDF-R). O objetivo deste estudo foi obter evidências experimentais para variantes de splicing Pnpla2 em ratinhos.

Materiais e Métodos: Foram utilizadas culturas de uma linha celular de ratinho derivada de fotorrecetores (células 661W) e tecidos oculares, cardíacos, adiposos, renais e hepáticos de ratinhos. O RNA mensageiro (mRNA) foi isolado das células e tecidos, e o DNA complementar (cDNA) foi sintetizado. Foram desenhados pares de iniciadores de reação em cadeia da polimerase (PCR) para flanquear os supostos locais de splicing. A PCR em tempo real de exclusão de exons foi utilizada para reduzir a amplificação do transcrito Pnpla2 completo e aumentar a amplificação de variantes de splicing pouco abundantes. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose e detetados com um transiluminador UV. Os plasmídeos recombinantes contendo um cDNA completo de PNPLA2 humano ou um cDNA de PNPLA2 sem o exão 5b (E5b) foram controlos para validar as técnicas. Foram preparados lisados ​​celulares totais de células 661W. A deteção da proteína PEDF-R foi realizada através de western blots.

Resultados: Os produtos de PCR para os transcritos de Pnpla2 obtidos a partir de células 661W ou de vários tecidos de ratinhos foram resolvidos numa única banda após amplificação com múltiplos pares de iniciadores. A amplificação simultânea de dois cDNAs de PNPLA2 em várias proporções molares impediu a detecção de transcritos mais baixos e abundantes. No entanto, mesmo quando o ADNc para o transcrito Pnpla2 completo foi significativamente excluído utilizando o método de exclusão de exões, não foram detetáveis ​​bandas correspondentes às variantes de splicing Pnpla2 . No entanto, western blots de lisados ​​de células 661W totais com dois anticorpos diferentes revelaram isoformas para a proteína PEDF-R.

Conclusões: Os dados fornecem evidências da existência de um único transcrito Pnpla2 completo que poderá dar origem a um único produto proteico que sofre processamento pós-traducional.