Jornal de Ensaios Clínicos
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Abstrato

Detecção sensível do receptor do factor de crescimento epidérmico T790M utilizando PCR em tempo real BNAClamp

Austin Dinkel, Rachel A. Hoffmeister, Andrew Huckelby, Aaron S. Castro, Miguel M. Castro, SungKun Kim*

As mutações no recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) causam uma variedade de cancros, incluindo o cancro da mama e do pulmão. A mutação única T790M no domínio tirosina quinase do EGFR significa a resposta aos medicamentos contra o cancro gefitinib, o que leva ao desenvolvimento de resistência a tal medicamento. A deteção da mutação proporciona, portanto, opções terapêuticas eficazes para os doentes que necessitam de tratamentos medicamentosos contra o cancro. Procurou-se desenvolver um método de deteção fácil e rápido para a mutação T790M utilizando ácidos nucleicos em ponte (BNA), que são conhecidos por aumentar a afinidade de hibridização de oligonucleótidos. Os oligonucleótidos contendo bases BNA, denominados BNA-clamp e concebidos para bloquear a reação de PCR contra genes do tipo selvagem, foram utilizados para discriminar a presença de genes mutantes misturados com um grande número de genes do tipo selvagem. A PCR em tempo real em conjugação com o clamp de BNA permite-nos observar diferentes graus de amplificação por PCR dependendo da proporção de genes de tipo selvagem e mutantes. Num esforço para explorar a possibilidade, foram preparados vários grampos de oligonucleótidos de 13-meros com vários números de bases de BNA. A análise do valor Tm sugere que os grampos contendo 9 bases de BNA (BNA-clamp-9) seriam mais eficazes para distinguir o mutante dos genes do tipo selvagem, e os testes de sensibilidade utilizando BNA-clamp-9 revelaram que o grampo tinha a capacidade de detetar 0,1% ou níveis inferiores da mutação T790M entre genes do tipo selvagem. Além disso, as estruturas de ligação foram analisadas através de simulações de Dinâmica Molecular (MD), revelando que o BNA-clamp-9 distorce a estrutura do BDNA originalmente construída. Além disso, através de amostragem guarda-chuva, foram obtidas energias livres de ligação com -60 kJ/mol para o tipo selvagem e -40 kJ/mol para o gene mutante. Esta tecnologia de pinçamento de BNA e PCR em tempo real pode oferecer um caminho promissor para detetar mutações clinicamente importantes no futuro