Avanços em Engenharia Genética
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Abstrato

As duas formas de controlar a expressão de CjCas9 na deleção da repetição patogénica de GAA no gene da frataxina

Pouiré Yaméogo

 A maioria dos casos de Ataxia de Friedrich é causada por uma inserção da sequência de repetição aGAA (GAAr) no primeiro intrão do frataxingene, levando a uma diminuição da expressão proteica. A exclusão deste GAAr pela tecnologia CRISPR-Cas9 leva a um aumento da expressão da infrataxina. Devido ao tamanho limitado da embalagem do AAV, a remoção do GAAr pelo SpCas9 exigiu dois vírus Adeno-associados (AAVs). A utilização de 2 AAV reduz a eficiência de um potencial tratamento, uma vez que cada célula deve estar infetada por ambos os vírus. Assim, utilizámos o CjCas9 porque é pequeno o suficiente para ser entregue com dois sgRNAs por um único AAV. No entanto, uma expressão constitutiva do gene CjCas9 entregue por um AAV in vivo pode aumentar as mutações off-target e induzir uma resposta imunitária contra a proteína Cas9. A expressão temporal é importante para o sistema CRISPR. Investigámos duas abordagens para limitar a expressão da nuclease. Em primeiro lugar, o Hara Kiri molecular, transfectámos simultaneamente em células HeLa plasmídeos que codificam CjCas9, dois guias (pré e pós GAAr) dirigidos ao frataxingene e dois guias dirigidos ao gene CjCas9. Os nossos resultados mostraram que apesar da autodestruição do gene CjCas9, foi obtida in vitro uma edição eficaz do genoma do gene FXN. Em segundo lugar, CRISPR-SCReT (Stop Codon Read Through), inserimos um stop codon (TGA) no início do gene CjCas9 para reprimir a sua expressão. Posteriormente, induzimos a expressão de Cas9 por moléculas capazes de permitir a tradução apesar da presença do códon de paragem prematuro. Este plasmídeo foi transfectado em células 293T com dois sgRNAs (pré e pós-GAAr). Observámos a deleção do GAAr apenas nas células tratadas com G418. Estes diferentes métodos permitiram obter uma edição eficiente do gene da frataxina, evitando uma expressão sustentada de Cas9. Isto poderia reduzir as hipóteses de mutações off-target e reação imunológica contra a proteína Cas9.