Jornal de Probióticos e Saúde
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Abstrato

Integridade da parede celular e formação de protoplastos do probiótico Lactobacillus acidophilus através de coloração fluorescente e microscopia de fluorescência

Ryan Page, David Burk, Kayanush Aryana

A identificação de protoplastos de células bacterianas utilizou anteriormente a microscopia de contraste de fase. Este método determina o protoplasto pelo seu tamanho e mudança de forma. Um método mais verificável pode ser utilizado utilizando manchas fluorescentes que têm como alvo os componentes celulares específicos. O objetivo deste estudo foi utilizar técnicas de microscopia de fluorescência para determinar a presença ou ausência de paredes celulares bacterianas no probiótico Lactobacillus acidophilus , após exposição a enzimas digestivas da parede celular. As células bacterianas foram tratadas com diferentes concentrações de lisozima [0, 175, 250, 425 μg/ml] e foram incubadas a 37ºC durante dez minutos. Após o tratamento com lisozima, as células foram coradas fluorescentemente com diferentes concentrações (1x, 2x, 10x e 100x) de dois corantes fluorescentes, a aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e o Hoechst 33342. O WGA [CF ^® 594 WGA, um corante vermelho fluorescente] foi utilizado para se ligar selectivamente a resíduos da camada de peptidoglicano da parede celular e Hoechst 33342, um corante azul fluorescente, foi utilizado para ligação específica a ácidos nucleicos de ADN de cadeia dupla de células bacterianas. Seguiu-se o método padrão para a preparação de amostras para microscopia de fluorescência. Foram estudados três campos para cada combinação de lisozima e corante. Foi realizada uma ANOVA unidirecional para determinar as diferenças nas concentrações de lisozima. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativamente diferente. A integridade estrutural da parede celular começou a deteriorar-se a 175 e 250 μg/ml de lisozima e a lise celular e as estrias de ADN aumentaram a uma concentração de 425 μg/ml. A concentração de lisozima de 175 μg/ml produziu em média 41% de protoplastos ou digestão parcial da parede celular. Um aumento de 175 para 250 μg/ml na concentração de lisozima resultou numa diminuição da percentagem média de protoplasto (4%). Na concentração de 425 μg/ml, a percentagem média de protoplasto diminuiu para 1%, ao mesmo tempo que apresentou um aumento das estrias de ADN. Na concentração de corante 1x, observou-se uma coloração parcial da parede celular. Em 2x, registou-se a coloração completa da parede celular. A 10x, observou-se uma coloração completa da parede celular e dos núcleos, semelhante às concentrações de corante a 2x, sem saturação significativa de corantes. A concentração do corante a 100x produziu uma sobresaturação dos corantes na parede celular e nos núcleos, fazendo com que se misturassem e inibissem a eficácia da identificação das células bacterianas e dos protoplastos. 2x foi o ideal para a coloração completa da parede celular e do núcleo. Foi observado ruído de fluorescência de fundo à medida que a concentração de corante aumentava. Em Lactobacillus acidophilus , uma concentração de lisozima de 175 μg/ml foi suficiente para a digestão da parede celular. A eficácia da concentração do corante foi melhor a 2x com a menor quantidade de ruído de fundo.