Jornal de antivirais e antirretrovirais
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Abstrato

Clonagem, Expressão e Purificação de Formas Recombinantes de Glicoproteína EBOV de Domínio Extracelular e de Comprimento Total em Linhagens Celulares de Mamíferos

Misaki Wayengera, Peace Babirye, Carol Musubika, Samuel Kirimunda, Moses L. Joloba

Enquadramento: A glicoproteína (GP) do Ebolavírus de comprimento total intercala a membrana lipídica mais externa para formar pontas, onde medeia a interação vírus-célula hospedeira. Uma forma secretora de GP (sGP) é também produzida por todas as 5 espécies conhecidas de Ebolavírus . Estes atributos fazem da GP um alvo ideal para a investigação e desenvolvimento (I e D) do Ebolavírus e possivelmente do pan-filovírus, testes de diagnóstico rápido (RDTs), bioterapêuticos e vacinas. A clonagem anterior do GP recombinante do ebolavírus do Zaire ( EBOV ) utilizou principalmente sistemas de expressão de insetos ( baculovírus ). Reportamos a clonagem, expressão e purificação das formas de domínio extracelular e de comprimento total (ECD) da GP de EBOV recombinante em linhagens celulares de mamíferos.

Métodos e resultados: Sequências de ADN codificantes de 2034 e 1956 pares de bases (pb) correspondentes aos resíduos de 669 e 643 aminoácidos (aa) de comprimento total e formas ECD de EBOV GP foram subclonadas nos plasmídeos pTGE. Os plasmídeos pTGE recombinantes foram utilizados para transfectar células de mamífero 293-6E HEK cultivadas em meio de expressão FreeStyleTM 293 isento de soro. Lisados ​​celulares e / ou sobrenadantes de cultura foram utilizados para a obtenção de proteína purificada, seguida de análise em SDS-PAGE e Western blot. O GP de comprimento total purificado foi detetado como proteína ligada à membrana em lisados ​​celulares com um peso molecular estimado de ~ 100 kDa (Cal.MW ~ 71,67 kDa) em Western blot; e 0,02 mg GP (Concentração: 0,2 mg/mL, Pureza: ~50%) derivados. Pelo contrário, o ECD GP foi detectado em sobrenadantes de caldo de cultura celular com pesos moleculares estimados de ~ 116 kDa com base em SDS-PAGE e Western blot; e foram obtidos 1,6 mg (Concentração: 0,4 mg/ml, Pureza: ~70%) de GP_ECD.

Conclusão: Dentro das células de mamíferos, a GP de EBOV de comprimento total recombinante é predominantemente expressa como proteína transmembranar (tGP), enquanto a GP de ECD é eluída no meio de cultura. Ambas as formas recombinantes de GP são críticas para a I&D de testes de diagnóstico rápido (RDT).