Engenharia Enzimática
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Abstrato

Isolamento, purificação e caracterização da estrutura secundária e estudo cinético da lipase da carpa indiana major, Catla catla (Catla)

Kameshwar Sharma YVR, Neelima Boora e Prasidhi Tyagi

Lipases são enzimas ubíquas que catalisam a hidrólise de gorduras em ácidos graxos e glicerol na interface água-lipídio e revertem a reação em meios não aquosos. As lipases ocupam um lugar de destaque entre os biocatalisadores devido às suas novas e múltiplas aplicações em oleoquímica, síntese orgânica, formulação de detergentes e nutrição. A lipase foi extraída e isolada do canal alimentar e intestino digestivo de Catla catla (catla). O tecido foi homogeneizado em uma proporção de 1:3 com tampão inicial (0,01 M TrisHCl, pH 7,2). O extrato bruto assim obtido foi precipitado usando sulfato de amônio (20-80%). O excesso de sal foi removido por diálise e o dialisado resultante (enzima dessalinizada) foi submetido à coluna DEAE-celulose para cromatografia de troca iônica a uma vazão de 0,5 ml/min. A eluição foi realizada por um gradiente de NaCl (100-800 mM) no tampão inicial. As frações ativas foram reunidas como Fração Purificada (PF) e foram usadas para caracterização física do pH, temperatura e efeito do cálcio na atividade enzimática, caracterização estrutural, caracterização molecular e para estudos cinéticos. A Fração Purificada (PF) mostrou atividade específica final de 1438,72 U/mg. O pH ótimo foi 7,8 e a temperatura ótima foi encontrada em 20°C. O valor da Temperatura de Fusão (Tm) foi de 42°C e a energia de ativação da lipase purificada foi de 34,82 KJ/mol/K. A estabilidade térmica da lipase foi encontrada em 20°C. A atividade da lipase foi mantida até 3 h de incubação com 10 mM e 20 mM de CaCl2 no tampão inicial. Isso mostra que o cálcio tem propriedade de aumento da desnaturação da enzima. A constante de Michaelis-Menten (Km) da lipase da carpa indiana major, catla para a hidrólise de pNPP foi de 6,695 mM. O número de turnover (kcat) da lipase (catla) foi de 0,0022 s-1. A eficiência catalítica (kcat/Km) da lipase foi de 0,0003412 s-1 mM-1. A SDS-PAGE da lipase purificada (PF) revelou uma banda única homogênea com massa molecular de 70 kDa. O arranjo estrutural secundário das hélices α e das fitas β da lipase purificada resulta em 48,51% e 9,74%, respectivamente, usando o Dicroísmo Circular.